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混合型生物洗油菌發(fā)酵上清液的表面張力值測(cè)定（二）
來(lái)源：東北石油大學(xué)三亞海洋油氣研究院 黑龍江省科學(xué)院微生物研究所 瀏覽 716 次 發(fā)布時(shí)間:2025-01-03
本實(shí)施方式中的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZZ-11于2023年9月，從哈爾濱市的農(nóng)作物根際土壤中分離純化獲得。
①分離方法采用梯度稀釋法：去除表土，取5~20cm深處的土樣幾十克石油污染土壤，盛入事先滅過(guò)菌的防水紙袋內(nèi)；取10g石油污染土壤在90mL無(wú)菌水三角瓶中振搖（搖床振搖30min靜置），然后取5mL上清液接種于95mL無(wú)菌的牛肉膏液體培養(yǎng)基中，在溫度為30℃、搖床轉(zhuǎn)速為150r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)2d；之后取土樣液逐級(jí)稀釋至10-6。挑取單菌落接種LB培養(yǎng)基平板中涂勻?于28℃恒溫培養(yǎng)。
②?純化方法?：反復(fù)劃線培養(yǎng)，直至確認(rèn)同一平板中菌落的形態(tài)和大小都相同，得到純化后的單菌株ZZ-11。
③革蘭氏染色：挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，鑒別細(xì)菌的類型。
④16s測(cè)序鑒定，該菌株16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
該菌株16S rDNA序列比對(duì)（NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)）與芽孢桿菌屬（Bacillus）的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）有極高的同源性，同源性為98%以上，并結(jié)合該菌株的革蘭氏染色（如圖1所示）和鏡檢結(jié)果認(rèn)定其為解淀粉芽孢桿菌，命名為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZZ-11。
圖1是解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZZ-11革蘭氏染色觀察圖；
本實(shí)施方式解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens
）ZZ-11可采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28~30℃。本實(shí)施方式解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZZ-11在LB固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為污白色圓形或不規(guī)則菌落，表面粗糙，粘稠（如圖2所示），經(jīng)革蘭氏染色為革蘭氏陽(yáng)性菌。
圖2是解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZZ-11平板培養(yǎng)菌落觀察圖；
具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式一種可用于洗油的微生物，其為膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）ZZ-8，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.30789。
本實(shí)施方式中的膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）ZZ-8于2023年9月，從哈爾濱市的農(nóng)作物根際土壤中分離純化獲得。
分離方法采用梯度稀釋法：去除表土，取5~20cm深處的土樣幾十克石油污染土壤，盛入事先滅過(guò)菌的防水紙袋內(nèi)；取10g石油污染土壤在90mL無(wú)菌水三角瓶中振搖（搖床振搖30min靜置），然后取5mL上清液接種于95mL無(wú)菌的牛肉膏液體培養(yǎng)基中，在溫度為30℃、搖床轉(zhuǎn)速為150r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)2d；之后取土樣液逐級(jí)稀釋至10-6。挑取單菌落接種LB培養(yǎng)基平板中涂勻?于28℃恒溫培養(yǎng)。
②?純化方法?：反復(fù)劃線培養(yǎng)，直至確認(rèn)同一平板中菌落的形態(tài)和大小都相同，得到純化后的單菌株ZZ-8。
③革蘭氏染色：挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，鑒別細(xì)菌的類型。
④16s測(cè)序鑒定，該菌株16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
該菌株16S rDNA序列比對(duì)（NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)）與芽孢桿菌屬（Bacillus）的膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus
）有極高的同源性，同源性為98%以上，并結(jié)合該菌株的革蘭氏染色（如圖3所示）和鏡檢結(jié)果認(rèn)定其為膠凍樣芽孢桿菌，命名為膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）ZZ-8。
圖3是膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）ZZ-8革蘭氏染色觀察圖；
本實(shí)施方式膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）ZZ-8可采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28~30℃。本實(shí)施方式膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus
）ZZ-8在LB固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為無(wú)色透明，有光澤，表面光滑，圓形隆起，粘稠、邊緣整齊（如圖4所示），經(jīng)革蘭氏染色為革蘭氏陰性菌。
圖4是膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）ZZ-8平板培養(yǎng)菌落觀察圖；
具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式用于微生物洗油的混合菌劑由解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZZ-11和膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）ZZ-8組成。
具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三的不同點(diǎn)在于：混合菌劑中解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZZ-11與膠凍樣芽孢桿菌（Bacillusmucilaginosus）ZZ-8的數(shù)量比為（108～109）:（107～108）。其它與具體實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三或四的不同點(diǎn)在于：混合菌劑中菌落總濃度為108～109cfu/mL。其它與具體實(shí)施方式三或四相同。
實(shí)施例1
乳化性能測(cè)試：
將解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZZ-11、膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）ZZ-8、混合菌劑（解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens
）ZZ-11和膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）ZZ-8按1:1數(shù)量比混合）分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28~30℃條件下振蕩培養(yǎng)發(fā)酵，直至發(fā)酵液中菌落濃度達(dá)到108
～109cfu/mL。
在25ml具塞量筒中分別加入上述5ml發(fā)酵液和5ml原油，隨后置于45℃恒溫箱內(nèi)20min。密閉后將具塞量筒劇烈振蕩5min，然后再次置于45℃恒溫箱中靜置，同時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔10min記錄試管中分離出水的體積，計(jì)算析水率。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。其公式為Ed=Vw/V，式中，Ed為析水率；Vw為析水量，mL；V為總體水相體積，mL。
利用析水率評(píng)價(jià)生物表面活性劑作用原油后形成水包油型乳狀液的穩(wěn)定性，析水率數(shù)值越小，說(shuō)明乳狀液越穩(wěn)定，體系的乳化性能越強(qiáng)。從圖中可以看出隨著時(shí)間的延長(zhǎng)各組析水率不斷增加，一段時(shí)間后ZZ-11、ZZ-8、混合菌劑的析水率穩(wěn)定，分別為47%、44%和16%（如圖5所示）。
圖5是實(shí)施例1乳化性能測(cè)試中ZZ-11、ZZ-8、混合菌劑析水率曲線圖。
析水率可用于評(píng)價(jià)生物表面活性劑對(duì)原油的乳化性能，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZZ-11和膠凍樣芽孢桿菌（Bacillusmucilaginosus）ZZ-8發(fā)酵液均具有良好的乳化性能，混合菌劑的乳化性能更為優(yōu)異和突出。